自CAR-T療法在2017年首次獲批以來，這一突破性療法的臨床前和臨床期開發(fā)出現(xiàn)了爆發(fā)式的增長。去年，楊森（Janssen）/南京傳奇、百時美施貴寶（BMS）、吉利德科學/Kite Pharma、和諸多中國生物醫(yī)藥公司開發(fā)的CAR-T療法亮出令人驚艷的數(shù)據(jù)。今年，更可能有2款以上CAR-T療法獲得FDA批準上市，將獲批療法的數(shù)目翻倍。
然而，獲批的CAR-T療法雖然在治療血液癌癥時展現(xiàn)出優(yōu)異和持久的療效，但是它的推廣卻面臨著多種挑戰(zhàn)。目前獲批上市的CAR-T療法為自體（autologous）CAR-T療法，這意味著醫(yī)生需要從患者體內(nèi)獲取T細胞，在體外通過基因工程在T細胞表面表達針對癌癥抗原的嵌合抗原受體（CAR），然后將增殖后的細胞輸回患者體內(nèi)。這一繁瑣的生產(chǎn)過程可能耗時長達3周，而且成本不菲。有些患者因為身體健康水平，前期治療等多種原因，無法提供足夠的T細胞，導致他們不能從這一突破性技術中獲益。
從健康供體中獲得細胞制造同種異體（allogeneic）CAR-T細胞有潛力解決自體CAR-T細胞面對的這些挑戰(zhàn)。新年伊始，Nature Reviews Drug Discovery上發(fā)表的一篇綜述對“即用型”同種異體CAR-T療法的開發(fā)現(xiàn)狀進行了深度盤點。
同種異體CAR-T細胞的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)
同種異體CAR-T細胞的制造流程起始于從健康供體中獲得的T細胞或者其它細胞類型，這些細胞在經(jīng)過基因工程改造，在細胞表面表達能夠靶向癌細胞的CAR之后，接受進一步基因編輯降低異體CAR-T細胞攻擊宿主的風險和宿主細胞排斥異體CAR-T細胞的可能。然后這些細胞經(jīng)過培養(yǎng)、增殖、提純、分裝成可以隨時使用的產(chǎn)品冷凍保存。
▲自體CAR-T和同種異體CAR-T療法的制造流程（圖片來源：Allogene公司官網(wǎng)）
這種CAR-T療法的優(yōu)勢在于：
從單一健康供體提供的細胞可以生成大量CAR-T細胞，滿足大量患者的需求。例如，致力于開發(fā)同種異體CAR-T細胞的Allogene公司表示，從一名健康供體中獲得的細胞可以制成治療100名癌癥患者的CAR-T療法。
這些細胞已經(jīng)生成并且冰凍在庫存中，需要接受治療的患者只需要解凍庫存的療法就可以立即接受治療，消除了自體CAR-T療法制造過程中產(chǎn)生的延遲。
而且，通常癌癥患者由于自身T細胞數(shù)目的限制，導致他們無法接受多次CAR-T療法的治療。而同種異體CAR-T療法可以更容易重復對患者進行治療，并且改變CAR-T療法靶向的抗原，克服對CAR-T療法的抗性。
然而，同種異體CAR-T療法的開發(fā)也需要面對獨特的兩大挑戰(zhàn)：一，輸入患者的異體細胞可能對宿主進行攻擊，導致危及患者生命的移植物抗宿主?。℅VHD）；二，異體細胞可能迅速被宿主的免疫細胞識別并消滅，限制它們的抗腫瘤活性。
解決移植物抗宿主病的策略
同種異體CAR-T細胞攻擊宿主組織的原因是因為這些T細胞表面表達的T細胞受體（TCR）能夠識別宿主組織上的異體抗原，從而引發(fā)T細胞對宿主組織的攻擊。目前，克服移植物抗宿主病的策略主要分為兩類，一類使用基因編輯方法消除T細胞上的天然TCR表達，另一類使用其它不會導致GVHD的細胞類型。
基因編輯方法消除T細胞的天然TCR表達
由于常用的αβ型T細胞表面天然表達的TCR是介導這些T細胞攻擊宿主的關鍵。研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種方法，防止TCR在這些細胞表面的表達。其中進展快的方法是使用基因編輯技術。αβ型T細胞表面的TCR蛋白復合體由α鏈和β鏈構成，只有一個基因編碼α鏈的恒定區(qū)（constant regions）。因此，破壞編碼T細胞受體α鏈恒定區(qū)（TRAC）的基因是阻止αβ型TCR表達直接有效的方法。利用這一策略產(chǎn)生的同種異體CAR-T療法已經(jīng)進入臨床試驗。
這一策略的優(yōu)勢在于，可以使用健康供體中大量的αβ型T細胞作為原材料制造CAR-T細胞。目前有多種基因編輯技術可以用于特異性破壞編碼TRAC的基因，它們包括鋅指核酸酶（ZFN），轉錄激活子樣效應因子核酸酶（TALEN），MegaTAL，和CRISPR基因編輯系統(tǒng)。在研究中，研究人員利用細胞的同源重組機制，將表達CAR的轉基因直接導入TRAC基因的位點。這一策略具有“一石二鳥”的效果，在破壞T細胞的天然TCR表達的同時，讓CAR轉基因在TRAC基因的位點表達，接受天然TCR基因啟動子的調(diào)控。動物試驗表明，這種策略產(chǎn)生的靶向CD19的CAR-T療法比隨機插入CAR轉基因生成的CAR-T療法具有更好的抗癌活性。
使用基因編輯策略的一個隱患是基因編輯技術的脫靶效應可能產(chǎn)生潛在風險。然而，由于異體細胞都會被宿主消滅，這一潛在風險的影響可能相對較低。
使用降低GVHD風險的細胞類型
降低異體CAR-T細胞攻擊宿主風險的另一個策略是使用不會產(chǎn)生GVHD或產(chǎn)生GVHD風險較低的細胞類型。它們包括天然殺傷細胞（NK細胞），γδ型T細胞，NK T細胞（表達NK細胞表面標志物的T細胞），病毒特異性記憶T細胞。
提高同種異體CAR-T細胞持久性的策略
雖然上述的多種方法可以降低輸入到患者體內(nèi)的異體CAR-T攻擊宿主的風險，但是同種異體CAR-T療法還需要解決另一項重大挑戰(zhàn)，那就是患者的免疫系統(tǒng)會識別這些細胞是“外來”細胞，從而對它們產(chǎn)生免疫排斥反應。這種免疫排斥會將輸入患者體內(nèi)的異體CAR-T細胞完全消滅。而由患者自身T細胞介導的免疫反應可能在異體CAR-T療法輸入時就馬上開始工作，降低異體CAR-T療法的療效。因此，如何提高同種異體CAR-T療法的持久性是這一領域急需解決的問題。目前解決這一問題的研究沿著下面的幾個方向進行：
更為有效的淋巴細胞清除手段
已有的研究已經(jīng)表明，想讓輸入的CAR-T細胞在患者體內(nèi)增殖，需要在輸入細胞之前先使用化療等手段清除患者體內(nèi)已有的淋巴細胞，從而為輸入的CAR-T細胞提供增殖的空間。對于同種異體CAR-T細胞來說，清除淋巴細胞這一步可能更為重要，因為殘存的宿主T細胞會立刻攻擊“外來”的CAR-T細胞。
目前一種在研方法是通過基因編輯讓同種異體的CAR-T細胞對清除T細胞的藥物產(chǎn)生抗性，這些細胞就不會受到清除T細胞藥物的影響。例如，Allogene公司開發(fā)的UCART19使用基因編輯手段，敲除了細胞表達CD52蛋白的基因。這讓這些細胞對通過與CD52相結合，殺死T細胞的單克隆抗體alemtuzumab產(chǎn)生抗性。將alemtuzumab與化療聯(lián)用可以更有效地清除宿主的成熟T細胞，并且將宿主的成熟T細胞維持在低水平。與此同時，同種異體的CAR-T療法仍然可以發(fā)揮作用。
▲通過抑制CAR-T細胞中CD52蛋白的表達提高CAR-T持久性的策略（圖片來源：Allogene官網(wǎng)）
基因編輯還可以讓同種異體的CAR-T細胞對清除T細胞的化療藥物產(chǎn)生抗性，從而讓它們在抑制T細胞生長的環(huán)境中正常工作。然而，這一策略的弊端在于患者體內(nèi)的內(nèi)源T細胞水平會被壓制到很低的水平，導致他們感染的風險顯著提高。
降低同種異體CAR-T細胞的免疫原性
器官移植和造血干細胞移植的經(jīng)驗表明，如果供體的主要人類白細胞抗原（HLA）表型與宿主的HLA表型相似，就可以大幅度減少對移植物的免疫排斥。基于這一經(jīng)驗，理論上可以通過發(fā)現(xiàn)具有特定HLA表型的供體，構建供體細胞庫，從中選擇與患者匹配的供體細胞生成同種異體CAR-T細胞。
由于1類HLA蛋白是介導免疫排斥因素的關鍵分子。另一種策略是使用基因工程手段，消除同種異體CAR-T細胞表面表達的1類HLA蛋白。HLA在細胞表面的表達需要名為β2-microglobulin的亞基，通過基因工程敲除β2-microglobulin的表達就可以防止HLA蛋白在細胞表面的表達，從而降低這些細胞的免疫原性。
▲HLA結構（圖片來源：User atropos235 on en.wikipedia [CC BY-SA (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)]）
選擇較好的T細胞亞群
T細胞群體包含多種具有不同功能和表型的T細胞亞群。而不同T細胞亞群在攻擊癌細胞的能力和在患者體內(nèi)的持久性等方面表現(xiàn)也大不相同。例如，臨床前研究表明，由CD8陽性和CD4陽性幼稚T細胞（na?ve T cell，TN）和中央記憶細胞（central memory T cells，TCM）生成的CAR-T細胞對癌細胞的殺傷能力更強。
而使用自體CAR-T療法治療慢性淋巴細胞白血病的臨床研究表明，TCM和具有自我復制能力的干細胞樣記憶性T細胞（stem-like memory T cell, TSCM）的質(zhì)量，以及細胞耗竭生物標志物的表達水平（包括PD-1， TIM3，LAG3等），是CAR-T療法活性和持久性的重要指標。
因此，通過改進篩選和細胞培養(yǎng)技術，可以富集特定的T細胞亞群，從而改善療法的持久性。在這一方面，從健康供體中獲得的T細胞可能具有潛在的優(yōu)勢，因為他們沒有接受過可能影響T細胞群體的前期療法的治療，因此可以提供包含豐富TN，TCM，和TSCM的T細胞。
同種異體CAR-T療法的臨床進展
目前，多項在研同種異體CAR-T療法已經(jīng)進入臨床試驗，治療急性淋巴細胞白血病和急性髓系白血?。ˋLL）患者等血液癌癥和實體瘤（見下表）。
2018年，Allogene公司開發(fā)的UCART19的初步臨床結果表明，在治療復發(fā)難治型ALL患者時，UCART19達到82%的完全緩解/血液學不完全恢復的完全緩解（CR/CRi）。由于UCART19在患者體內(nèi)的持續(xù)時間有限，接受UCART19的兒科患者隨后接受了造血干細胞移植療法。
CAR-T和細胞療法的未來
關于“即用型”CAR-T療法，業(yè)內(nèi)也有著兩派不同的觀點。許多人相信，它能解決CAR-T療法難以制備，生產(chǎn)周期長的痛點，為全球更多病患帶來治療的新希望；但也有一些專家相信，“即用型”CAR-T療法只是一時的“權宜之計”。歸根結底，是我們對“自體型”CAR-T療法的洞見還不夠深刻。
近來，藥明康德內(nèi)容團隊與多名細胞療法領域的權威專家進行了對話。其中，Lyell Immunopharma的創(chuàng)始人兼執(zhí)行官Rick Klausner博士展望了細胞療法的未來。這名美國國家癌癥中心（NCI）的前負責人指出，目前研發(fā)“即用型”CAR-T療法的動力之一，在于當下制造“自體型”CAR-T療法的種種瓶頸。然而我們需要認識到，當下制造CAR-T療法的技術遠未臻成熟。5-10年后，細胞療法的研發(fā)與生產(chǎn)制造勢必將與現(xiàn)在大不一樣。
Klausner博士提到，目前的細胞療法生產(chǎn)之所以耗時費力，在于我們并不知道其中的哪些細胞真正具有治療的效力。因此我們只能不斷擴增T細胞，希望在天文數(shù)字的細胞中，具有療效的細胞數(shù)能夠達標。而在未來，如果我們能分離出那些具有療效的細胞亞群，就能大幅降低治療癌癥所需的細胞數(shù)目。這能極大地減少我們所需培養(yǎng)的細胞數(shù)量，并把細胞療法的生產(chǎn)時間從數(shù)周縮短到短短幾天。
這聽起來像是天方夜譚，卻代表了未來的一個前進方向。要知道，在一臺計算器要占去一整間房屋的時代，也沒有多少人能預想到智能手機的出現(xiàn)。而兩者之間，相隔只有數(shù)十年。
MD安德森癌癥中心的癌癥醫(yī)學部主任Patrick Hwu博士則指出了不同的應用前景。對于某些比較敏感的癌癥來說，“即用型”的CAR-T療法在短期內(nèi)就能起到很好的效果，因此不必過于擔心它被免疫系統(tǒng)所排斥的問題。而對于實體瘤，我們希望T細胞在腫瘤附近停留盡量久的時間，“自體型”的CAR-T療法則會有更大的發(fā)揮空間。
而我們要知道，關于“即用型”和“自體型”CAR-T療法的熱議，只是細胞療法的冰山一角。是的，自獲批以來，CAR-T療法領域吸引了大量的目光和關注。但兩位專家指出，細胞療法，并不是只有CAR-T療法一種。T細胞療法以外的細胞療法，同樣是未來的發(fā)展方向。而基因與細胞療法有望在生物技術的浪潮之下，為全球病患帶來新的突破。
參考資料：
[1] Depil et al., (2020). ‘Off- the-shelf’ allogeneic CAR T cells: development and challenges. Nature Reviews Drug Discovery, https://doi.org/10.1038/s41573-019-0051-2
[2] Allogen Corporate Presentation. Retrieved January 5, 2020, from https://ir.allogene.com/static-files/f44b1f83-83eb-4cd0-b0fa-4f327b17fefb
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