中山大學合作發(fā)文：發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌潛在候選靶點
7月29日，中山大學與南華大學研究人員合作共同在期刊《Advanced Science》發(fā)表了題為“Autophagy Deficiency Induced by SAT1 Potentiates Tumor Progression in Triple-Negative Breast Cancer”的研究論文，本研究發(fā)現(xiàn)SAT1高表達的TNBC患者預后較差。SAT1敲低可有效抑制TNBC細胞的體內外增殖和遷移能力。在機制上，轉錄因子JUN通過與啟動子區(qū)結合增強SAT1的轉錄活性。然后，細胞質中的SAT1蛋白通過E3連接酶HERC5介導的去泛素化作用與YBX1蛋白直接結合，從而維持YBX1蛋白的穩(wěn)定性。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)SAT1通過穩(wěn)定mTOR mRNA和積累ybx1介導的甲基-5-胞嘧啶(m5C)修飾來顯著抑制自噬。SAT1通過SAT1/YBX1/mTOR軸驅動TNBC的進展，為晚期TNBC的靶向治療提供了潛在的候選靶點。
背景知識
乳腺癌是全球女性健康的首要問題，不同分子亞型的乳腺癌患者的生存結局存在顯著差異。由于缺乏雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)和人表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor receptor 2, HER2)， 15% ~ 20%的乳腺癌被定義為三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer, tnbc)。揭示導致TNBC發(fā)生發(fā)展的分子過程仍然是一個挑戰(zhàn)，尤其是為TNBC患者量身定制的治療。
大多數(shù)真核細胞都維持著基本的自噬水平，這種過程被定義為將選擇性的細胞內容包裹在雙層膜囊泡中形成自噬體，然后與溶酶體融合進行降解。自噬在腫瘤發(fā)生和抗腫瘤治療反應中起作用。在腫瘤發(fā)生初期，自噬作為腫瘤防御者發(fā)揮作用，例如，貝克林-1（Beclin-1）敲除促進了具有TNBC特征的乳腺上皮細胞的腫瘤發(fā)生。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)高表達自噬基因ATG7能夠抑制TNBC進展并誘導TNBC細胞凋亡，這可能有助于改善TNBC患者的預后和有利的臨床病理特征。因此，闡明自噬的分子調節(jié)機制可能揭示TNBC的潛在治療靶點。
SAT1表達水平高可促進三陰性乳腺癌（TNBC）在體外和體內的進展
由于SAT1的高表達與TNBC患者的不良預后相關，它應該也對腫瘤行為有深遠的影響。通過RT-qPCR和western blot，研究人員首先檢測了SAT1在多個三陰性乳腺癌細胞系中的表達，在BT549和SUM159PT細胞中表達較強，而在MDA-MB-231細胞中表達相對較弱。利用慢病毒包裝系統(tǒng)，在BT549和SUM159PT細胞中穩(wěn)定敲低SAT1，在MDA-MB-231細胞中過表達SAT1。CCK8和克隆形成實驗證實SAT1能有效促進TNBC細胞增殖。同樣，在體外劃痕愈合實驗和遷移實驗中，上調SAT1可增強TNBC細胞的遷移能力。由于上皮-間充質轉化(EMT)是癌癥進展和轉移的重要標志，EMT相關蛋白也被發(fā)現(xiàn)在SAT1敲低時失活。以上實驗數(shù)據(jù)證實了SAT1在TNBC中的體外促腫瘤能力。
為了確定SAT1在體內的重要功能，研究人員分別建立了雌性BALB/c裸鼠的皮下移植瘤和肝轉移模型。從異種移植模型中可以觀察到，SAT1KD細胞所形成的腫瘤體積顯著縮小，這也表現(xiàn)在腫瘤生長的減少。從SAT1KD異種移植模型中提取的腫瘤中EMT相關蛋白的表達水平也如預期的那樣下降。肝轉移模型建立成功后6周，活體生物發(fā)光成像顯示SAT1KD組肝轉移灶縮小。在肝轉移模型的HE染色中，研究人員也觀察到SAT1KD組的轉移結節(jié)更少、更小。以上結論為研究人員的后續(xù)研究奠定了基礎。
SAT1敲低可抑制體內TNBC的進展
SAT1/YBX1通過m5C修飾增強mTOR mRNA的穩(wěn)定性
作為“看門人”，mTOR信號通路一直是限制自噬激活的核心。因此，研究人員假設SAT1/YBX1復合物抑制的自噬很可能是通過mTOR信號通路介導的。首先，在早期的TNBC數(shù)據(jù)集(GSE38959)中，GSEA分析顯示SAT1和YBX1分別與mTOR信號通路呈正相關。mTOR及其下游分子在SAT1KD細胞中表達顯著降低，而過表達YBX1可以恢復這一現(xiàn)象。RT-qPCR分析表明，降低SAT1和YBX1的表達會顯著抑制mTOR的轉錄水平，這提示SAT1/YBX1復合物有能力在轉錄水平監(jiān)測mTOR。因此，研究人員使用放線菌素D來檢測mTOR的mRNA穩(wěn)定性是否會影響SAT1或YBX1。隨著放線菌素D暴露時間的延長，mTOR mRNA的數(shù)量在YBX1沉默的BT549細胞中有更大水平的下降，相反，在YBX1過表達的細胞中有更多的積累。更令人印象深刻的是，在SAT1KD BT549細胞中減少的mTOR mRNA可以被YBX1過表達恢復。這些數(shù)據(jù)表明在TNBC中SAT1通過YBX1介導維持mTOR mRNA的穩(wěn)定。
近期的研究已經確定YBX1是細胞質mRNA m5C修飾的讀取器，其普遍性在RNA代謝調控中發(fā)揮著關鍵作用。研究人員推測，SAT1/YBX1復合物可能通過YBX1對mTOR mRNA進行m5C修飾，從而抑制自噬。首先，在BT549細胞中使用YBX1抗體的RIP實驗顯示YBX1蛋白直接與mTOR mRNA結合。同樣地，YBX1通過生物素標記探針特異性識別mTOR mRNA而被沉淀下來。點印跡實驗顯示，YBX1抑制導致m5C水平降低，而過表達YBX1則導致m5C水平升高。研究人員還觀察到，SAT1KD細胞中降低的m5C水平可以通過YBX1過表達得到恢復，這表明SAT1/YBX1軸調節(jié)的mTOR mRNA穩(wěn)定性主要受m5C修飾的調控。從分離的RNA中獲得的mRNA含有更高的m5C水平。從RIP實驗中可以看出，mTOR mRNA不僅能與m5C抗體結合，而且SAT1下調導致的m5C整合減弱可以通過YBX1逆轉。根據(jù)這些結果，研究人員得出結論：SAT1通過YBX1介導的m5C修飾來維持mTOR的mRNA，從而抑制自噬，有利于TNBC的進展。
研究小結
綜上，本研究表明SAT1可作為TNBC患者靶向治療策略的潛在候選靶點，SAT1在TNBC中高表達，被證實通過SAT1/YBX1/mTOR軸促進腫瘤進展。
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