安徽醫(yī)科大學林寧團隊：發(fā)現(xiàn)膠質瘤免疫治療新靶點
7月28日，安徽醫(yī)科大學林寧研究團隊在期刊《Cell Death Discovery》上發(fā)表了題為“EZH2–STAT3 signaling pathway regulates GSDMD-mediated pyroptosis in glioblastoma”的研究論文，本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)EZH2抑制劑3-Deazaneplanocin A (DZNep)可以誘導GBM細胞焦亡。此外，本研究揭示了信號轉導和轉錄激活因子(STAT3)可以作為受EZH2影響的下游調節(jié)因子，影響GBM中的細胞焦亡。DZNep和STAT3抑制劑(SH-4-54)處理后，細胞焦亡相關因子nod樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 (NLRP3)和Gasdermin D (GSDMD)水平升高。同時抑制EZH2和STAT3可導致IL-1β和IL-18等炎癥因子的表達。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)EZH2通過STAT3調控膠質母細胞瘤中的細胞焦亡，而細胞焦亡有可能成為膠質母細胞瘤免疫治療的靶點。
背景知識
多形性膠質母細胞瘤(GBM)是常見的原發(fā)性腦腫瘤，具有生長迅速、侵襲性強、致死率高等特點。目前GBM的治療以手術為主，輔以放療和化療。然而，由于GBM獨特的組織結構，腫瘤與正常組織界限不清，術后復發(fā)率仍然較高。GBM患者的中位生存期僅為15個月。此外，化療對GBM的療效欠佳，血腦屏障的存在影響了GBM的療效。目前的研究主要集中在揭示GBM的發(fā)病機制，誘導GBM中的程序性細胞死亡是主要的研究方向。GBM中凋亡和自噬的研究相對成熟，有多條經過驗證的分子通路。然而，對于GBM中細胞焦亡的研究尚處于實驗階段，缺乏相關的分子機制。了解GBM中調控細胞焦亡的分子信號通路，可為膠質瘤患者提供潛在的治療方向。
細胞焦亡是一種受調控的細胞死亡形式，依賴于Gasdermin蛋白家族，導致膜穿孔。焦亡細胞發(fā)生腫脹直至膜破裂，導致細胞內因子外排。在此過程中，IL-1β和IL-18等促炎細胞因子的大量釋放，從而引發(fā)強烈的炎癥反應。在細胞焦亡的經典途徑中，Caspase-1裂解Gasdermin D (GSDMD)，產生裂解的n -末端GSDMD (N-GSDMD)。因此，膜孔形成，鉀外流，大量炎癥因子釋放到細胞外空間。這些事件終導致細胞死亡并改變腫瘤微環(huán)境。此外，細胞焦亡的激活需要NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 (NLRP3)炎性小體，而NLRP3炎性小體是組裝炎性小體的關鍵分子。炎癥小體與Caspase-1結合后，GSDMD被裂解，誘導細胞焦亡。近年來的研究普遍認為，細胞焦亡可直接裂解細胞并誘導免疫細胞浸潤，抑制腫瘤生長，在多種細胞生理過程中發(fā)揮作用，尤其是在惡性腫瘤的生長中。
DZNep抑制GBM細胞功能并誘導細胞死亡
為了評估EZH2抑制后GBM細胞活力的變化，研究人員用濃度為20 μM的DZNep測定了U87的細胞活力。CCK-8檢測顯示，DZNep處理后第3天，U87細胞活力顯著降低。隨后，在菌落形成實驗中，DZNep顯著降低了U87細胞形成的菌落數(shù)量。在U87傷口愈合實驗中，研究人員觀察到dznep處理組的劃痕寬度明顯大于對照組。在遷移實驗中，dznep處理組的U87細胞通過間隙和基質的遷移能力明顯低于對照組。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)DZNep處理后U87細胞呈典型的熱噬泡形態(tài)。隨后的Calcein/PI染色顯示DZNep處理后死細胞增多，活細胞顯著減少。流式細胞術分析進一步證實，DZNep處理后的部分死亡細胞屬于凋亡類型。綜上所述，DZNep顯著抑制GBM細胞功能，誘導細胞凋亡。
DZNep抑制GBM細胞功能，誘導細胞死亡
EZH2作為STAT3的上游調控因子，通過炎性體調控焦亡
研究人員深入研究了EZH2和STAT3之間的聯(lián)系，特別關注p-STAT。免疫熒光(IF)染色證實EZH2(綠色)和p-STAT3(紅色)在U87中共定位，主要集中在細胞核內。與正常膠質瘤細胞系HA1800相比，定量PCR (qPCR)分析顯示，EZH2和STAT3在膠質瘤細胞系U87、H4和A172中表達較高。此外，DZNep處理后，U87和LN229的STAT3總量沒有明顯變化，而p-STAT3隨著劑量的增加而減少。同時，DZNep治療后炎性小體成分NLRP3蛋白水平升高，在20 μM時顯著升高。同樣，DZNep處理(20 μM)后，焦亡蛋白GSDMD和N-GSDMD的蛋白水平顯著升高。這些發(fā)現(xiàn)表明EZH2和STAT3之間存在相互關系，使它們能夠調節(jié)膠質瘤焦亡。
抑制STAT3激活焦亡并抑制膠質瘤細胞增殖
根據(jù)前期研究，EZH2可通過炎性體調控STAT3的磷酸化水平，激活膠質瘤細胞的焦亡。隨后，研究人員使用STAT3抑制劑SH-4-54進行干預，SH-4-54 (10 μM)可以抑制p-STAT3蛋白的表達。它還具有提高活化NLRP3、GSDMD和N-GSDMD蛋白表達水平的能力。在光學顯微鏡下，研究人員觀察到SH-4-54處理后的U87細胞有明顯的焦亡泡。SH-4-54組U87細胞培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)含量顯著升高。用EdU檢測膠質瘤細胞系的增殖，SH-4-54可以抑制U87和LN229的增殖。
RO8191逆轉sh -4 - 54介導的膠質瘤細胞死亡和焦亡
前期研究表明STAT3作為EZH2的下游靶點，可以調控焦亡。使用STAT3激動劑(ro8191,10 μM)可以逆轉sh -4 - 54激活的U87和LN229的焦亡。同時，在顯微鏡下觀察到SH-4-54使U87和LN229失去了原來的細胞形態(tài)，而RO8191可以逆轉這些形態(tài)變化，使細胞恢復到原來的形態(tài)。此外，RO8191可以減少SH-4-54引起的細胞死亡，與SH-4-54組相比，RO8191組的死亡細胞明顯減少。這些結果表明EZH2通過STAT3調控膠質瘤細胞的凋亡和功能，而RO8191可以逆轉這一過程。
研究小結
本研究將EZH2引入膠質瘤焦亡領域。EZH2抑制劑DZNep的使用不僅可以抑制膠質瘤的發(fā)生發(fā)展，還可以激活膠質瘤焦亡。同時，研究人員證明通過EZH2抑制p-STAT3可增強NLRP3炎性體活性，促進膠質瘤焦亡和炎癥因子IL-1β和IL-18的表達。本研究發(fā)現(xiàn)為神經膠質瘤焦亡的研究提供了一個潛在的信號通路。
聲明：本文版權歸原作者所有，轉載文章僅為傳播更多信息，如作者信息標記有誤，或侵犯您的版權，請聯(lián)系我們，我們將在及時修改或刪除內容，聯(lián)系郵箱：marketing@360worldcare.com
