溫州醫(yī)科大學蘇志鵬團隊：發(fā)現(xiàn)膠質瘤患者治療新策略
8月19日，溫州醫(yī)科大學蘇志鵬研究團隊在期刊《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上發(fā)表了研究論文，題為“SelK promotes glioblastoma cell proliferation by inhibiting β-TrCP1 mediated ubiquitin-dependent degradation of CDK4”，本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)與長期存活者(≥3年)相比，SelK在短期存活者(≤1年)的GB樣本中顯著上調，且其表達水平與臨床預后呈負相關。抑制SelK表達降低裸鼠GB細胞活力，誘導G0/G1期阻滯，損害移植膠質瘤細胞的生長。Selk誘導的內質網應激下調導致SKP2表達降低，β-TrCP1表達上調。上調β-TrCP1，從而加速泛素依賴性CDK4的降解，終抑制GB細胞的惡性增殖。
背景知識
膠質母細胞瘤(GB)是中樞神經系統(tǒng)致命、頑固的惡性實體腫瘤之一。盡管外科、藥物和放療治療取得了進展，但GB患者的預后仍然極差，中位生存期為14.6個月，1、2、3和5年生存率分別僅為39.3%、16.9%、9.9%和5.5%。少數存活≥3年的GB患者被稱為長期生存者(long-term survivors, LTS)。在研究當前治療產生持久療效的能力的決定因素時，這一患者群體仍然很重要。
靶向治療正在成為改善GB患者預后的可行治療選擇。研究表明，貝伐珠單抗(VEGF抑制劑)和達可替尼(EGFR抑制劑)在臨床實踐中顯示出前景。然而，GB是一種高度異質性的腫瘤，單靶點治療的療效有限。因此，識別多個靶點，采用多模式聯(lián)合治療是GB治療的未來。因此，迫切需要探索靶向腫瘤細胞的新的、高度特異的治療靶點，以提高當前治療的敏感性，為GB患者的長期獲益提供更多希望。
腫瘤細胞的惡性增殖是對患者健康產生負面影響的關鍵因素。盡管研究取得了進展，發(fā)現(xiàn)了許多基因和蛋白質的異常，但信號轉導通路的失調和細胞周期控制的喪失仍然是GB的突出問題。多項研究表明，減小腫瘤組織體積和抑制腫瘤細胞增殖既可以緩解神經癥狀，又可以優(yōu)化放化療的療效。
SelK在人GB細胞株中表達上調，敲低SelK表達可抑制GB細胞的生長
研究人員通過蛋白質免疫印跡實驗檢測了SelK在人正常星形膠質細胞(NHA)和不同人GB細胞系中的表達，探討了SelK在GB發(fā)育中的潛在作用。SelK在人GB細胞株中的表達高于NHA細胞。研究人員通過光密度分析進一步證實了SelK的表達水平明顯升高，尤其是在LN229和U251細胞株中。隨后，在LN229和U251細胞中使用shRNA敲低SelK，構建穩(wěn)定敲低SelK的細胞株。研究人員還通過蛋白質免疫印跡實驗驗證了敲低效果，并選擇shSelK#1和shSelK#2來研究SelK在GB發(fā)育中的作用。通過ATP實驗、軟瓊脂實驗、平板克隆形成實驗和EdU實驗評估SelK對細胞增殖和腫瘤生長的潛在作用。結果表明，敲低SelK可顯著抑制GB細胞的惡性增殖能力。實驗結果還表明，SelK過表達顯著促進GB細胞的惡性增殖。這些結果表明，SelK可能在GB細胞的體外發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用。
SelK在人GB細胞株中表達上調，敲低SelK表達可抑制GB細胞的生長
敲低SelK顯著抑制體內膠質母細胞瘤細胞的惡性增殖能力
為了評估SelK對GB體內增殖能力的影響，研究人員將SelK敲低細胞LN229、U251或非義控制細胞通過皮下注射注入BALB/c-裸鼠體內，建立異種移植腫瘤模型。28天后，評估小鼠及其腫瘤的生長和體積。分析表明，體內敲低SelK顯著抑制了LN229和U251細胞的增殖能力，表現(xiàn)為腫瘤體積和重量的減少。同時分析腫瘤中增殖標記物Ki67（IHC）的蛋白表達水平，研究人員發(fā)現(xiàn)來自SelK敲低細胞的腫瘤組織中SelK和Ki67的蛋白表達水平顯著降低。這些結果表明，體內敲低SelK可能抑制GB細胞的增殖能力。
上調SKP2表達并促進SKP2介導的β-TrCP1泛素化
上述結果表明，β-TrCP1在GB細胞的生長中起著關鍵作用，在SelK的影響下，它是CDK4的關鍵調節(jié)因子。此外，定量PCR分析顯示，SelK主要在蛋白質水平上調節(jié)β-TrCP1，因為在敲除SelK的GB細胞中，β-TrCP1的轉錄水平沒有明顯變化。
為了進一步探究SelK對GB細胞生長進程的影響，研究人員進行了蛋白質降解實驗，以評估SelK對β-TrCP1穩(wěn)定性的影響。實驗結果表明，與對照組細胞相比，SelK敲除細胞中的β-TrCP1更穩(wěn)定，這表明SelK抑制了β-TrCP1的降解速率。研究人員還評估了SelK敲除GB細胞中SKP2和SMURF2的表達。數據顯示，SMURF2蛋白水平沒有明顯變化，而SKP2水平在上述細胞中持續(xù)下調。因此，這些數據表明SelK可能通過增加SKP2蛋白水平和降低β-TrCP1表達來促進CDK4蛋白表達。
為了研究SKP2與β-TrCP1之間的相互作用，并確定SelK介導的SKP2調節(jié)是否影響惡性GB細胞的增殖，在LN229細胞和穩(wěn)定細胞系中過表達SKP2。有趣的是，在SKP2過表達的SelK敲除細胞中，β-TrCP1蛋白水平降低。進一步分析顯示，與對照細胞相比，SKP2過表達導致LN229細胞的增殖增加，無論是在ATP或軟瓊脂培養(yǎng)基中均是如此。蛋白質降解實驗表明，在SelK敲除和SKP2過表達的細胞中，β-TrCP1蛋白降解速度高于對照細胞。此外，蛋白質降解實驗還表明，在SelK敲除和SKP2過表達的細胞中，CDK4比對照細胞更穩(wěn)定。綜上所述，這些結果共同表明，SelK通過增加SKP2的蛋白質水平來增強β-TrCP1的泛素化，導致β-TrCP1蛋白表達降低和CDK4蛋白表達增加，終促進GB細胞增殖。
研究小結
總之，本研究證明了SelK/內質網應激/SKP2/β-TrCP1/CDK4軸在GB增殖中的重要作用。從這些發(fā)現(xiàn)來看，可以清楚地看出SelK是GB細胞發(fā)育和/或維持過程中的一個重要致癌分子。因此，開發(fā)能夠靶向SelK及其下游效應物的小分子抑制劑或激動劑，可能會有助于指導GB患者的治療策略。
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