北京大學鄧宏魁團隊成功研發(fā)雙屬性iTNK細胞
2024年8月30日， 北京大學生命科學學院鄧宏魁團隊在期刊《Cell Reports Methods》上發(fā)表了題為“Generation of dual-attribute iTNK cells from hPSCs for cancer immunotherapy”的研究論文。在這項研究中，團隊從hPSC生成雙屬性誘導的T-NK（iTNK）細胞，表達細胞毒性T和NK細胞的標志物。單細胞RNA和T細胞受體（TCR）測序分析顯示，iTNK細胞表達與NK和T細胞相關的特征基因，并表現(xiàn)出多樣化的TCR庫。iTNK細胞釋放細胞毒性介質，對多種腫瘤細胞系發(fā)揮細胞毒性，并在體內抑制腫瘤生長。通過利用適應性和先天免疫反應，hPSC衍生的iTNK細胞，為癌癥免疫治療，提供了有前途的策略。
研究背景
雙屬性免疫細胞結合了細胞毒性T細胞和自然殺傷（NK）細胞的優(yōu)勢，為免疫療法提供了一種有吸引力的途徑。不變的自然殺傷T（iNKT）細胞，具有獨特的識別特性，通過多種機制的溶細胞特性顯示出前景，但可用性有限。人體血液中含有極少量的iNKT細胞，在許多癌癥患者中，它們的數(shù)量和功能減少，這限制了它們在癌癥治療中的潛在臨床應用。為了克服這一限制，體外擴增的iNKT細胞，來自iNKT細胞來源的誘導多能干細胞（iPSC）的再分化iNKT細胞和造血干細胞工程iNKT細胞已經產生，并顯示出癌癥治療的潛力。
以前的研究通過在體外對原代T淋巴細胞進行基因編輯或培養(yǎng)，來產生雙屬性免疫細胞。Bcl11b的基因缺失將T細胞重編程為誘導的T到NK（ITNK）細胞，這些細胞表現(xiàn)出NK細胞特性，并降低一些T細胞特征基因的表達。人ITNK細胞也可以通過使臍帶血或外周血T細胞中的BCL11B失活來產生。這些細胞表現(xiàn)出先天性和適應性特征，顯示出不依賴T細胞受體（TCR）的抗腫瘤細胞毒性。涉及自體ITNK細胞的臨床研究，顯示出有希望的結果，患者經歷了腫瘤穩(wěn)定和部分緩解。此外，細胞因子誘導的殺傷（CIK）細胞，包括CD3CD56細胞，在癌癥治療結果方面表現(xiàn)出一些改善。迄今為止的證據表明，雙屬性細胞在腫瘤免疫治療中，具有相當大的潛在用途。
然而，獲得足夠的雙屬性細胞以進行廣泛的臨床使用，仍然是一個挑戰(zhàn)。人類多能干細胞（hPSC），例如，胚胎干細胞（ESC）、23iPSCs和化學誘導的多能干細胞（CiPSC），為產生豐富的功能細胞，提供理想的細胞來源。然而，科學界尚未實現(xiàn)從hPSC生產用于臨床應用的雙屬性細胞。
為了解決這一限制，這項研究介紹了一種從hPSC生產雙屬性誘導的T-NK（iTNK）細胞的方法。產生并富集造血祖細胞（HPC），以誘導T細胞譜系的產生；隨后，成功生成了iTNK細胞。這些細胞同時表達CD8 T細胞和NK細胞特征基因，表現(xiàn)出多樣化的TCR庫，并在刺激和殺傷過程中，釋放高水平的各種細胞毒性介質。iTNK細胞通過來自CD3-TCR復合物和NK受體的信號傳導，對各種腫瘤細胞系，表現(xiàn)出有效的細胞毒性。此外，低劑量的iTNK細胞有效地抑制了體內腫瘤生長。研究結果表明，使用一種有前途的殺傷細胞類型，開發(fā)增強型癌癥免疫療法的潛力。
圖形摘要
研究進展
在3D和2D系統(tǒng)中將hPSC分化為HPC
淋巴樣細胞來源于造血干細胞/祖細胞，因此，需要誘導HPC作為初步步驟。通過優(yōu)化團隊之前的協(xié)議，團隊成功地建立了一個化學定義的方案，用于3D和2D系統(tǒng)中序貫中胚層誘導和造血誘導。這是使用人CiPSC（hCiPSC）系CiPS-3、hESC系H1和hiPSC系iPS-7實現(xiàn)的。在3D系統(tǒng)中，hPSCs發(fā)生自聚集，形成胚胎體。經過10天的誘導期后，團隊獲得了CD34 HPC，由大約2/3的CD31CD43CD45細胞和1/3的CD31CD43組成CD45系列細胞。在2D系統(tǒng)中，hPSC接種在玻連蛋白包被的平板上，并以2D形態(tài)分化。經過12天的誘導期后，產生的CD34HPC主要是CD31CD43CD45細胞。CD34 HPC在3D和2D系統(tǒng)中的平均純度，約為24%和30%。就產量而言，100萬個hPSC在3D系統(tǒng)中產生了大約45萬個CD34HPC，而它們在2D系統(tǒng)中產生了316萬個CD34 HPC。在兩個系統(tǒng)中，所有3種細胞系，都可以分化為HPC。
從hPSC生成iTNK細胞
iTNK細胞對腫瘤細胞具有強效的細胞毒性
團隊構建了異位表達OKT3的OKT3 NALM-6細胞，用于CD3-TCR復合物刺激，iTNK細胞有效裂解OKT3 NALM-6細胞，但表現(xiàn)出對NALM-6細胞的有限裂解，表明iTNK細胞可以通過OKT3刺激，實現(xiàn)細胞毒性。iTNK細胞還對實體瘤細胞系表現(xiàn)出有效的細胞毒性，包括HCT116、HepG2、A375和MDA-MB-231。與NK細胞類似，iTNK細胞可以在4小時內實現(xiàn)腫瘤細胞殺傷，并在12小時內表現(xiàn)出更高的效率。NKp30的抑制，降低了iTNK細胞對A375細胞的殺傷效率。因此，iTNK細胞通過CD3-TCR復合物介導和NK受體介導的腫瘤細胞殺傷細胞毒性，表現(xiàn)出雙重靶向。
在與HCT116腫瘤細胞共培養(yǎng)時，與NK細胞相比，iTNK細胞釋放更高水平的IFN-γ、顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素、IL-17A、顆粒溶血素、IL-2和IL-10。在與NALM-6-OKT3腫瘤細胞共培養(yǎng)時，iTNK細胞表現(xiàn)出比T細胞更高水平的顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素、IL-17A、顆粒溶血素、IL-10和sFasL。此外，T細胞中IFN-γ的釋放水平較高。這些結果表明，iTNK細胞在腫瘤殺傷過程中，表現(xiàn)出更大的多樣性和更高水平的細胞毒性介質。
iTNK細胞在3周內顯著抑制HCT116結直腸癌異種移植模型中的腫瘤生長，而不會對小鼠體重或外觀造成不利影響。在iTNK細胞注射后3天，檢測到小鼠血液中穿孔素、顆粒溶血和IFN-γ的釋放。觀察到iTNK細胞浸潤到腫瘤、肝臟、肺和脾臟中。這些結果表明iTNK細胞的體內功能。
iTNK細胞的活化和細胞毒性
研究結論
這項研究成功地展示了iTNK細胞強大的腫瘤殺傷能力，并為它們從hPSC衍生，建立了穩(wěn)健的方法。iTNK細胞用于腫瘤免疫治療的潛力是巨大的。鑒于iTNK細胞表現(xiàn)出的細胞毒性T細胞和NK細胞的雙重屬性和組合功能，本研究為開發(fā)以iTNK細胞為中心的創(chuàng)新免疫治療策略，鋪平了道路。
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